激光共聚焦顯微鏡的基本觀察步驟

　　激光共聚焦顯微鏡是一種高分辨率的顯微成像技術。普通的熒光光學顯微鏡在對較厚的標本(例如細胞)進行觀察時，來自觀察點鄰近區(qū)域的熒光會對結(jié)構(gòu)的分辨率形成較大的干擾。共聚焦顯微技術的關鍵點在于，每次只對空間上的一個點(焦點)進行成像，再通過計算機控制的一點一點的掃描形成標本的二維或者三維圖象。在此過程中，來自焦點以外的光信號不會對圖像形成干擾，從而大大提高了顯微圖象的清晰度和細節(jié)分辨能力。
 

　　樣品制備是檢測前的關鍵步驟，樣品需要用熒光探針(單，雙和三)標記。標本可以是固定的或活組織，或固定或活的貼壁培養(yǎng)。細胞應在共聚焦特殊培養(yǎng)皿或蓋玻片，懸浮細胞，萼片或滴劑和蓋玻片上培養(yǎng)，覆蓋。樣品厚度約1~2mm，蓋玻片厚度應小于0.17mm，滑塊厚度應在0.8~1.2mm之間，表面光滑，厚度均勻，并且沒有明顯的干擾熒光。固定樣品通常用密封片密封，通常使用通過使用pH 8.5-9的PBS制備的甘油密封。
 

　　根據(jù)實驗要求制備樣品完畢后。即可進行觀察，基本步驟如下：
 

　　(1)開啟儀器電源及光源：一般先開啟激光共聚焦顯微鏡和激光器，再啟動計算機，然后啟動操作軟件，設置熒光樣品的激發(fā)光波長，選擇相應的濾光鏡組塊。以便光電倍增管檢測器能得到足夠的信號結(jié)果。
 

　　(2)設置相應的掃描方式：在目視模式下.調(diào)整所用物鏡放大倍數(shù)，在顯微鏡下找到需要檢測的細胞。切換到掃描模式，調(diào)整雙孔針和激光強度參數(shù)，即可得到清晰的共聚焦圖像。
 

　　(3)獲取圖像：選擇合適的圖像分辨率，將樣品完整掃描后，保存圖像結(jié)果即可。
 

　　(4)關閉儀器：儀器測定樣品結(jié)束后，先關閉激光器部分，計算機仍可繼續(xù)進行圖像和數(shù)據(jù)處理。若要退出整個激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)，則應該在激光器關閉后，待其冷卻至少10分鐘后再關閉計算機及總開關。